专利摘要:

公开号:WO1989005851A1
申请号:PCT/JP1988/001311
申请日:1988-12-23
公开日:1989-06-29
发明作者:Atsushi Imaizumi;Yorimasa Suwa;Masahiro Okada;Yoji Suzuki;Ichiro Kudo;Keizo Inoue;Shuntaro Hara;Kunio Matsuta;Terumasa Miyamoto
申请人:Teijin Limited;
IPC主号:C12N9-00
专利说明:
[0001] 明 i . 発明の名称
[0002] 新規なヒ ト ' ホスホ リ パーゼ A 2 及びそのフラ グ メ ン トペプチ ド
[0003] 技術分野
[0004] 本発明は、 N端部が特定のア ミ ノ酸配列であるホスホ リ パーゼ A 2 活性を有する蛋白に閬する 。
[0005] n s - ί又 ¾J
[0006] ホスホ リ パーゼ A 2 はホス フ ァ チジルコ リ ンの 位ェ ステル結合を加水分解 し、 リ ゾホス フ ァ チジルコ リ ン と 脂肪酸を生成する酵素であ り 、 哺乳類滕臓, へビ毒, お よびハチ毒等にその存在が、 知られて いる 。 これらホス ホ リ パーゼ A 2 活性を もつ蛋白の う ち、 蛇毒由来の もの 約 35種, 哺乳類藤臓由来の もの約 5 種、 およびハチ毒由 来の もの 1 種の一次構造はすでに決定されて いる ( 生化 学第 5 7卷, 第 1 号 I 7〜54 ) 。 これら構造決定された酵 素は分泌性ホスホ リ パーゼ A 2 と して分類され、 比較的 含量が多 く 、 分.離 ' 精製が容易だったこ と から 、 これま でに分子レベルでめ研究が数多 く 行なわれて き た。 それ らによ る と 現在までに知られて いるホスホ リ パーゼ A 2 は比較的低分子 ( 1 3, 000〜 1 4, 00 G ) であ り 、 また分子内 に多 く の S— S結合 ( 6 〜 7組 ) を含むので、 高温, 極 端な酸性またはアルカ リ性の溶液中において も 、 また高 濃度の変性剤 (尿素, 塩酸グァニジン, 種々 の有機溶媒 ) を含む溶液中において もかな り 安定な蛋白である 5 多 く のホスホ リパーゼ A z は酸性または中性の蛋白であるが、 強塩基性の もの も あ り 、 このもめは神経毒性, 筋肉毒性, 心朦毒性等の強い生理作用を示 し、 主に蛇毒, ハチ毒の 毒素の本昧と されて いる 。
[0007] 哺乳類滕臓由来ホスホ リパーゼ A z はプロ酵素と して 分泌され、 ト リ プシンなどのプロテアーゼな どによ って N末蠲の 7 残基のぺプチ ド断片が限定分解を受けて除去 され活性型ホスホ リパーゼ A 2 と なる こ と が知られてい る 。 晡乳類膝臓由来ホスホ リ パーゼ A 2 の う ちゥシと ブ タ滕臓由来ホスホ リパーゼ A z についてはかな り 詳細な X線結晶解析が報告されている 。 ヒ ト藤臓由来ホスホ リ パーゼ A z については、 一次配列がすでに決定されて い るが ( Vat o! j . H. M. eta I 983 B i oc h【 ΕΠ . g i o s . Ac ta 74. 793-99 } , X線結晶解析はまだ成功していない。 ヒ ト膝臓由来ホスホ リパーゼ 2 は最近そのク ローニング も行なわれ、 遣伝子レベルから もそのア ミ ノ酸一次配列 が解明された ( Sei ihenier. J. J. Randalに T. L. Ya anaka. M. and Jo onson L. .1986 DNA. Vo I5 519-527 ) 。 これら晡 乳類藤臛由来ホスホ リパーゼ A 2 の作用と しては、 藤臓 よ り分泌される消化酵素と しての役割が考え られている 。
[0008] —方、 哺乳類の S範な臓器組織あるいは紲胞において ホスホ リ パーゼ A 2 活性が認め られて いる 。 これらのこ と から 、 哺乳類膝臓由来ホスホ リ パーゼ A 2 以外のホス ホ リ パーゼ A 2 の存在が示唆されて いる 。 阀えば、 脳 . 肝臓, 肺臓, 脾臓, 小腸, 白血球, 赤血球, 血小板, マ ク ロ フ ァ ージ, 軟骨細胞, 炎症組織等から もホスホ リ ノ、" ーゼ A 2 活性が認め られ、 ホスホ リ パーゼ A 2 の単離 - 精製も試み られて いる 。
[0009] これらの う ち、 特にヒ ト生体内ホスホ リパーゼ A 2 は、 通常の リ ン脂質代謝及び膜の流動性の抑制 と と も にァラ キ ド ン酸代謝の初期過程な どにおいて重要な役割を果す 酵素である こ と が知られて いる 。 従って これらの構造と 機能の解明は、 炎症, 感染, 免疫等にかかわる疾患を制 御する上で重要な意義を有する と 考え られる 。 しか な が ら現在までの と こ ろ 、 ヒ ト についてはヒ ト膝臓由来ホ スホ リ パーゼ A 2 以外めホスホ リ パーゼ A 2 については、 一部単離 · 精製が試み られて いるが、 未だその全一次配 列は判明 して いない。 わずかに動物において 、 冽えば豚 小腸由来のホスホ リ パーゼ A 2 について一部そのア ミ ノ 酸配列が判明 して いるのみである 。 ( Varger. R.に eta I 1982 B I ochm i stry 21 3883-6889 ) 。 これは蛇毒, ヒ ト 膝臓由来ホスホ リ パーゼ 2 に比較 して 、 これらのホス ホ リ パーゼ A 2 は存在量が少なく 、 分離 ■ 精製が困難で あるため と 考え られて いる 。
[0010] 一方動物において 、 最近、 井上 らは、 カゼイ ン投与時 のラ ッ 卜腹腔中に見い出されるホスホ リ パーゼ A z を単 離 · 精製 し、 その性質を調べている (生化学 V o l 5 8 No. 8 7 6 6 1 936 } 。 それによれば、 この精製酵素 1 0 0 n g を ラ ッ ト背部皮内に接種する と 、 あ らかじめ静脈投与 したェ バンスブルーが漏出 し、 局所での血管透過性が亢進する こ と が見い出されている 。 一方哺乳類滕臓由来のホスホ リパーゼ A z はこの活性を示さないこ と も確認している 従って生体内での役割が明確に異なる と思われるホスホ リ パーゼ A 2 の存在が示唆され、 炎症特異的なホスホ リ パーゼ A 2 と して注目 されて いる 。
[0011] このよ う な炎症に鬨与する と考え られる ヒ ト 由来ホス ホ リ パーゼ A 2 については、 各種疾患, 例えば、 乾癡の 皮フ , 敗血症の血清, リ ウマチ閔節內液等にホスホ リパ ーゼ A 2 活性の上昇が認められてお り 、 これらのホスホ リパーゼ A 2 と炎症と の閲連性に興味がもたれて いる 。 上述のよ う に、 炎症に関与する と考え られる t ト 由来 ホスホ リパーゼ A 2 は、 炎症, 感染, 免疫等のかかわる 疾患の治療上、 その構造と機能の解明は重要な意義を有 する と考え られる 。 にもかかわらず、 その単離 · 精製が 困難であるため、 かかるホスホ リパーゼ A 2 が提供され ず、 それについての研究もほと んどなされていなかった 発明の開示
[0012] 従来技術のかかる問題点に鑑みて 、 本発明者らは、 ヒ 卜由来であって 、 且つ薛臓由来ホスホ リパーゼ A 2 と は ア ミ ノ酸の一次配列の異なるホスホ リ パーゼ A 2 、 特に 炎症に閲与 し、 起炎性に作用するであろ う ホスホ リ パ一 ゼ A 2 に関 して鋭意探索の結果、 本発明に到達 した もの である 。 すなわち本発明は、 N端部のア ミ ノ酸配列が下 記式 [ I ]
[0013] NHs -Asn-Leu-Val-Asn-P e-X-X-Met-I le-X-Leu-Thr-Thr -Gly-Lys-Glu-Ala-Ala-Leu-X-Tyr-Gly-P e-Tyr-Gly-
[0014] … [ I ] であるホスホ リ パーゼ A 2 活性を有する蛋白 、 及び N端 部のア ミ ノ酸配列が下記式 [ E ] 、
[0015] H2 - Asn-Leu-Vat-Asn-P e-His-Arg-Met-I I e- Lys- Leu- Thr - Thr - Gly - Lys - Glu - Ala-Ala - Leu - Ser -了 yr - Gly - Phe - 了 yr-G I y - Cys - X - Cys - G I y - Vaト G I y-G I y-Arg-G I y ·■■ [ E ] であるホスホ リ パーゼ A 2 活性を有する蛋白である 。
[0016] 特に好ま し く は本発明は、 ヒ ト炎症局所由来で分子量 が約 13 , 700である N端部が上記ア ミ ノ酸配列である ホス ホ リパーゼ A 2 活性を有する蛋白である 。
[0017] 更にまた本発明は、 ア ミ ノ酸配列が少な く と も上記式
[0018] [ I ] , [ E ] のア ミ ノ酸配列を有するポ リ ペプチ ド、 及びア ミ ノ酸配列が上記式 [ I ] , [ E ] のア ミ ノ酸配 列を有するポ リ ペプチ ド及びその断片である 。 上記式
[0019] [ I ] , [ 互 ] において 、 Xはア ミ ノ酸残基は存在する が、 シーケンサーに於て そのア ミ ノ酸残基が判定でき な かった ものを示す。
[0020] 図面の簡単な説明 第 1 図はへパ リ ンセ フ ァ ロース CL6Bのァ フ ィ ニテ ィ 一 ク ロマ 卜グラ フ ィ 一を用いた 目的蛋白の溶出パターンを 示す。
[0021] 第 2 図は疎水カラムク ロマ トグラ フ ィ ーを用いた 目的 蛋白の溶出パターンを示す。
[0022] 第 3 図は逆相 HPLCを用いた目的蛋白の溶出パターンを 示す。
[0023] 第 4図は逆相 HPLCで精製 した 目的蛋白の SDS PAGEを示 す
[0024] 第 5図は目的蛋白のホスホ リパーゼ A 2 活性発現のた めのカルシウムイ オン要求性を示す。
[0025] 第 6 図は 目的蛋白ののホスホ リパーゼ A 2 活性発現に 必要な至適 PHを示す。
[0026] 第 7 図は目的蛋白の基質特異性を示す動力学データで ある 。
[0027] 第 8図は慢性鬨節リ ウマチ及び変形性鬨節症患者の関 節内液中のホスホ リパーゼ A z 活性を示す。
[0028] 発明を実施するための最良の形態
[0029] こ こで本発明のホスホ リ パーゼ A 2 活性を有する蛋白 に到る基質特異性について述べる 。 徒来、 跎毒あるいは 滕臓由来のホスホ リ パーゼ八 2 の研究から 、 各種ホスホ リパーゼ A 2 は起源によ り その基質特異性が異な り 、 ま た、 基質の分散状態によ って も大き く その酵素活性が影 響を受ける こ と が知られて いる 。 一般に、 ホスホ リパー ゼ A 2 は単分子分散状基質に対 しては低い活性 しか示さ ないが、 ミ セル状基質に対 しては著 し く 高い活性を示す これは、 ホスホ リ パーゼ A 2 分子が、 触媒反応を行な う 活性部位に加えて 、 水相 と 基貲 ミ セルと の界面を認識す る部位を有するためである ど考え られて いる 。 哺乳類滕 臓由来ホスホ リパーゼ A 2 はプロ酵素であるが、 プロ酵 素と 活性型酵素は共に必須金属イ オン C a ++に対 して 同 程度の親和性を も ち、 単分子状基質に対 しては同程度の ホスホ リパーゼ A 2 活性を示す。 プロ酵素と活性型酵素 の違いは、 ミ セル状基質に対 して前者が低い活性 しか示 さないのに対 し、 後者は著 し く 高い活性を示すこ と であ る。 これはプロ酵素の限定分解に伴ない N末端周辺に界 面認識部位が 成されるため と 者え られて いる 。 このよ う に N末端都の配列は、 生体内に於いての基質認識に重 要なパー トである 。 本発明の蛋白は、 このよ う に基質特 異性に密接に関係する新規な N末端部の配列からなるホ スホ リ ノ、。ーゼ A 2 活性を有する ものである 。
[0030] 次に本発明のホスホ リパーゼ A 2 话性を有する蛋白の 単離 · 精製方法について述べる 。
[0031] 本発明のホスホ リパーゼ A 2 活性を有する蛋白を単離 - 精製する際の出発材料と しては、 炎症性疾患部、 特に 慢性関節 リ ゥマチ疾患部由来の ものが好ま し く 用いられ る.。 本発明者らは、 炎症性疾患 と して例えば慢性関節 リ ゥマチ症及び変^性関節症に着目 して 、 その関節内液の ホスホ リ パーゼ A 2 活性を測定 した。 その結果、 第 8図 に示すよ う に慢性関節リ ウマチ患者、 特にその症^が重 度の患者にホスホ リパーゼ A z 活性の上舁が認められ、 変形性関節症にはその活性が認め られなかった。
[0032] 本発明のホスホ リ パーゼ A z 活性を有する蛋白は、 上 記の如く 、 例えば慢性関節リ ゥマチ患者の関節内液を出 発材料と して 、 以下の如き方法で単離 ' 精製される 。 ホ スホ リパーゼ A 2 活性を指標に して 、 例えば、 へパ リ ン セフ ァ ロース · ァフ ィ 二テ ィ ーク ロマ 卜グラ フ ィ 一に出 発材料をアプライ し、 各画分のホスホ リパーゼ A2 活性 を測定し、 活性ピーク を得る 。 その後疎水ク ロマ ト ■ 逆 相ク ロマ ト等によ り 、 目的蛋白を精製し、 S D S P A にて単一な蛋白を得る φ このよ う な方法によ って 、 例えば約 40(5 ml出発材料から、 ホスホ リパーゼ A 2 话性 を有する蛋白を約 単離でき る 。 本蛋白の性質は、 分子量約 , 700, C a ++イ オン要求性で、 4 mM付近に 至適カルシウムイ オン濃度を有 し、 基質と してはホスフ ァ チジルエタ ノールア ミ ンをホスフ ァ チジルコ リ ンよ り も好んで加水分解し、 至適 PH約 9.5で、 N端部からのァ ミ ノ酸の一次配列が NH2 -Asn-Leu-Val-Asn-Phe-X-X-Met -Ite-X-Leu-Thr-Thr-Gly-Lys-Glu-Ala-Ala-Leu-X-Tyr- G ly-Phe-Tyr-Gly-さ らに詳細には NH2 -Asn-Leu- Va i -Asn -Phe-His-Arg-Het-Ile-Lys-Leu-Thr-Thr-Giy-Lys-Glu- Aia-Ala-Leu-Ser-Tyr-Gly-P e-Tyr-Gty-Cys-X-Cys-Gty- Va ! -Gf y-G iy-Arg-G ly である蛋白であった 4 これを現在 までの知られて いるホスホ リ パーゼ A 2 と 比較 した と こ ろ、 ヒ ト滕臓由来ホスホ リ パーゼ A 2 と も異なる 、 ま つ た く 新規な構造を有するホスホ リパーゼ A 2 であ る こ と がわかった。 以上、 本発明のホスホ リ パーゼ A 2 活性を 有する蛋白を 、 慢性関節リ ウマチ患者の関節内液を出発 材料と して精製 · 単離する方法を中心に説明 したが、 本 発明において 、 蛋白起源や蛋白の製法はなんら限定され る ものではない。 ヒ ト以外に他の動物から抽出、 精製 - 単離 して も よ く 、 また遺伝子工学的手法で微生物ある い は動物細胞から製造 して も よ い。 上記特定の N端部であ るホスホ リ パーゼ A 2 活性を有する蛋白である限 り 、 本 発明に含まれる ものである 。
[0033] 上述の如く 、 本発明のホスホ リ パーゼ A 2 活性を有す る蛋白は、 炎症性疾患部, 特に慢性関節 リ ウマチ関節内 液において 、 その酵素活性が顕著に認め られるので、 こ の酵素量及び话性を測定する こ と によ って慢性関節 リ ゥ マチの診断あるいは病態把握によ る治療が出来る可能性 があ り 、 その際本蛋白及びそのフ ラ グメ ン ト ( 断片 ) は 重要な抗原と な り 得る 。 また、 最近癌治療には癌局所に 炎症を生ぜ しめ、 その結果癌細胞を駆逐する方法が知ら れているが、 本蛋白の起炎性着目すれば癌治療も夢では ない。 また細胞膜の修復にホスホ リ パーゼ A 2 が関与す る こ と が示唆されて いる こ と から 、 創傷治癒剤と しての 可能性 示唆されている 。 更に本蛋白酵素に対する特異 的な阻害物質は、 抗炎症剤と しての可能性が考え られ、 そのよ う な阻害剤をスク リ ーニング して得るための酵素 源と しては、 なく てはな らない唯一の蛋白である 。 また 更に、 本発明のア ミ ノ酸配列が少なく と も前記式 [ I ] , [ I ] のア ミ ノ酸配列を有するポリ ペプチ ド 、 及び前記 式 [ I ] , [ S ] のアミ ノ酸配列を有するポリペプチ ド 及びその断片は基質と の競合に於いて 、 このホスホ リ パ ーゼ A 2 活性を阻害する可能性があるため、 阻害剤と し ての可能性も示唆される 。
[0034] かかる断片と しては、 前記式 [ I ] , [ E ] のァ ミ ノ 酸配列の う ち、 任意の部分 2〜25又は 2 〜 30からなる も のがあるが、 なかでも N端部から 5〜 7番目 までのア ミ ノ酸配列が、 既述の如き基質特異性と の関係で、 ホスホ リ パーゼ A 2 活性阻害が予想される 。
[0035] 生体内におけるホスホ リパーゼ A 2 の役割が明確にな りつつある現在、 本発明者らが提供 した本蛋白及びポリ ペプチ ド等の利用価値は大き い。
[0036] 本発明において用いられた各種試験, 測定法は以下の 通 り である 。
[0037] (1) ホスホ リパーゼ A z 活性め測定法
[0038] 基質と しては 14 C酢酸を E . co l iに取 り 込ませ、 w Cでラベル化されたホスフ ァチジルエタ ノールア ミ ン を抽出 して用いた。 1G0mM Tris -HCJ ( PH9.0 ) , 4mM Caa 2 , 50nmo i w C—ホス フ ァ チジルェタ ノ ールァ ミ ンからなる反応系に各種サンプルを入れ、 37 で 30分間イ ンキュベー トする 。 その後 Dole試薬で反応 を停止させる 。 ホス フ ァ ジルエタ ノールァ ミ ンが加水 分解されて生成 したラベル化脂肪酸をヘプタ ンで抽出 後、 液体シンチレーシ ヨ ンカ ウンタ一にて その量を測 定する 。
[0039] (2) SDS ポ リ アク リ ルア ミ ド電気泳動 (SDS PAG[)
[0040] 各種ク ロマ 卜的手法によ り 分画 した試料の一部を取 り 、 1 %SI3S , 2 —メルカプ トエタ ノール存在下、 100 で-で 10分間加熱 した。 次いで、 12.5%ポ リ ァク リ ルア ミ ド ゲルに試料をアプライ し、 15 fii Aで 1 · 5 時間 電気泳動 した。 泳動終了後、 バイ オラ ッ ド社製シルバ ーステ ィ ンキ ッ トで染色 した 。
[0041] (3) 蛋白一次構造の決定法
[0042] 気相プロテイ ンシーケンサー ( アプライ ド ■ バイ オ システム社 . model477A ) を用いて決定 した。 即ち、 単離精製されたサンプル約 2 g を 、 3G u の ト リ フ ルォロ酢酸 ( TFA)に溶解 し、 上記気相プロティ ンシー ケンサ一にアプライ した 4 自動的にエ ドマン分解され た PTH ( フ エ二ルチオヒ ダン ト イ ン ) ア ミ ノ酸誘導体 は、 その後、 高速液体ク ロマ ト グラ フ ィ ー ( アプライ ド ' ノ ィ ォシステム社 . Mode卜 120A) にて各ア ミ ノ酸 と して分析された。 ぐ実施例 >
[0043] 以下、 実施例によ り本発明を詳逮する 実施例 1
[0044] ホスホ リ パーゼ A 2 活性を有する蛋白の精製 ■ 単離
[0045] (a) へノ リ ン一セ フ ァ ロースク ロマ ト グラ フ ィ ーによ る 目的蛋白の分離精製
[0046] 慢性リ ウマチ患者鬨節液約 42ひ ml を出発材料と し、 まず遠心分離によ り 細胞、 その他固彤咸分を除いた上 清を、 20Π1Μ ト リ ス塩酸緩衝液にて平衡に したへパリ ン一セ フ ァ ロース CL6Bカ ラム ( 25雌 X 8Q麵 ) にァプ ライ し、 0.15〜 1. GMの Na で流速 0.3mi Zniin で溶 出させた。 その結果を第 1 図に示した。 第 1 図の破線 はホスホ リパーゼ A 2 活性を 、 実線は U V 280nnt にお ける吸収で蛋白量を表わしたものであるが、 N aC 濃度 勾配 0.7M付近から著明なホスホ リパーゼ A 2 活性が 認められた。
[0047] (b) 疎水カラムク ロマ トグラ フ ィ ーによ る 目的蛋白の 分離精製
[0048] 上記ホスホ リ パーゼ A 2 活性を有する画分を更に穑 製するために、 この活性画分をプールして藤水力ラム ク ロマ トグラ フ ィ ー ( プチル ト ヨパール ® 650カラム
[0049] 1 G腿 X 275mm ) に流速 0.7 ml / m i Π でアプライ した 溶出は 2Q M ト リ ス塩酸 PH 7.4, 1 M NaC , 硫安濃度 をステ ップワイ ズに 3 G % , 20% , 15% , 10% , 0 %へ と 変化させた。 各溶出液のホスホ リ パーゼ A 2 话性を 第 2 図に示す。 第 2 図の破線はホスホ リ パーゼ A 2 话 性を 、 実線は U V 280nm における吸収で蛋白量を表わ した もめであるが、 硫安濃度 10%に於いてホスホ リ パ 一ゼ 2 の活性が認め られた この活性画分の SDS-PA GEを行ない、 更に精製が必要なこ と を確認 した。
[0050] (C) 逆相高速液体ク ロマ トグラ フ ィ ー ( HPLC) によ る 目的蛋白の分離精製
[0051] 疎水カラムク ロマ 卜グラ フ ィ 一でホスホ リパーゼ A z 活性を検出 した画分を 、 0.1 % TF で平衡化 した 逆相 HPLC(TSK— ge I O0S- 120T, 4.6 腿 X 150 纖 ) にアプライ した。 目的蛋白は、 流速 0.5 mi / m i n で第 3 図破線で示すァセ トニ 卜 リル直線濃度勾配にて溶出 させた。 ホスホ リ パーゼ A z 活性は第 3 図の太破線マ ル印に示す画分に認め られ、 その画分の SDS-PAGEの結 果を第 4 図に示す。 目的とするホスホ リパーゼ A 2 は 分子量約 13,700に単一バン ド と して認め られた。 実施例 2
[0052] 実施例 1 において精製単離したホスホ リ パーゼ A 2 活 性を有する蛋白の生化学性質を明らかにするために本蛋 白のカルシウムイ オン要求性, 至適 PH, 更に基質特異性 に関 し、 前述のホスホ リパーゼ A 2 活性の測定方法にお いて 、 Ca« 2 の濃度を変えて 、 ある いは ト リ ス塩酸緩衝 液の PHを変え、 基質と してホスフ ァチジエタ ノールア ミ ン ( P E ) と ホスフ ァチジルコ リ ン ( PC ) を用いて調べた。 その結果を第 5 図〜第 7 図に示す。 第 5図において破線 は基質と して PEを用いた場合の各種カルシウムイ オン濃 度におけるホスホ リパーゼ A 2 活性を表わ して いる 。 第 5 図から明らかなよ う に、 すでに知られて いるホスホ リ パーゼ A 2 と 同様に、 本発明の蛋白にもカルシウム要求 性は認め られ 4 mM付近に至適カルシウムイオン濃度が 存在した。 第 6 図において破線は基質と して PEの場合、 二重線は PCの場合における至適 PHを表わ した ものである が、 本発明の蛋白は PH 9付近に至適 PH濃度を もち、 基質 と して PCよ り PEを好んで加水分解する こ とが判る 。 第 7 図は、 本発明の蛋白の基質特異性を示す動力学的データ を示した もので、 図中一 一で表わされる PCよ り も 、 一 〇一で表わされる に特異的である こ と が明らかである 。 実施例 3
[0053] 実旛例 1 で精製単離したサンプルの蛋白一次構造の一 都を 、 前述の気相プロテ イ ンシーケンサ一によ り決定し た。 その結果、 このホスホ リパーゼ A 2 の N末端部のァ ミ ノ酸配列は以下の通り であった。
[0054] NH2 -Asn-Leu-Va l -Asn-P e-X-X-Met-I l e-X-Leu-T r-Thr -Gi y-Lys-G l u-A t a-A l a-Leu-X-Tyr-G i y-P e-Tyr-G t y- であった。 こ こ に Xは、 シーケンサーにおいてそのア ミ ノ酸残基が判定出来なかった ものを示す。 実施例 4
[0055] 実施例 1 で精製単離 したサンプルを用いて 、 そのア ミ ノ酸組成及び蛋白一次構造の一部を決定 した。
[0056] (a) ア ミ ノ睽組成
[0057] サンプルを塩酸で加水分解 し、 次いで 37で, 2 時間 6 Mグァニジン - H ^mM E D T A Z 0.5M Tris -HCi ( PH8.1 )中、 ジチオスレィ トールでジスルフ ィ ド 結合を還元 した後、 ョー ドアセ トア ミ ドでカルボキシ メ チルア ミ ド化 した。 このよ う に得られたサンプ ( 0.5 M s ) のア ミ ノ酸組成を 、 Ish idaら ( J. Chroma tog 204, 143-148, 1981)の方法に徒って 、 0 - フ タル アルデヒ ド . ポス トカ ラム ■ デ リ ノくテ ィ ゼーシ ヨ ン法 によ って決定 した。
[0058] 結果を第 1 表に示す。
[0059] Asx 7.1
[0060] G!x 6.6
[0061] Ser 6.1
[0062] G!y 9.9
[0063] His 2.3
[0064] A rg 8. &
[0065] Thr 6.8
[0066] A I a 7.3
[0067] Pro 2.9
[0068] Ty r 6.3
[0069] Val 2.6
[0070] Met 0.8
[0071] I le 2.8
[0072] Leu 4.9
[0073] Phe 3.7
[0074] Lys 7.3
[0075] Cys U.0 (d: S-carboxymethylcysteine ) Trp n. d. (e: ¾ -,
[0076] (b) 蛋白一次構造
[0077] 実旅倒 3 と 同様に して 、 気相プロテイ ンシーケンサ
[0078] 一によ り浃定 した。 その結果、 このホスホ リパーゼ A 2 の N末端部のア ミ ノ酸配列は以下の通 り であった。
[0079] Asn-Leu-Va l -Asn-Phe-H i s-Arg-Met-I i e-Lys-Leu-Thr-
[0080] Thr-G l y- Lys-G l u-A l a-A l a-Leu-Ser-Tyr-G l y-Phe-Tyr-
[0081] G l y-Cys-X-Cys-G i y-Va l -G l y-G l y-Arg-G l y- 実施例 3で得られた結果と比較する と 、 N末端部厠か ら 1 〜 5 , 8 , 9 , 11〜19, 21〜 25番目のア ミ ノ酸が 一致 して いる こ と が判る 。 なお、 上記式において X は、 シーケンサーにおいて そのア ミ ノ酸残基が特定でき な かった ものを示す。
[0082] 産業上の利用可能性
[0083] 本発明は P L A 2 活性を有する蛋白に閬する 。
[0084] 本発明の蛋白は、 慢性関節 リ ウマチの診断又は病態把 握のための免疫測定の抗原と して 、 ある いはそめ起炎性 によ って 、 癌局所に炎症を生ぜ しめて癌治療する こ と 等 に利用する こ と ができ る 。
权利要求:
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であるホスホ リ パーゼ A 2 活性を有する蛋白 。
6. ヒ ト炎症局所由来で、 分子量が約 13, 700である請 求の範囲第 5項記載のホスホ リ パーゼ A 2 活性を有す る蛋白 。
7. ア ミ ノ酸配列が少な く と も下記式 [ Π ] 、
H2 -Asn-Leu-Va l -Asn-Phe-H i s-Arg-Met- i l e-Lys- Leu
-Thr-Thr-G t y-Lys-G l u-A l a-A l a- Leu-Ser-Tyr-G l y-Phe -Tyr-G t y-Cys-X-Cys-G l y-Va l -G l y-G t y-Arg-G l y-" [ 2 ] のア ミ ノ酸配列を有するポリ ペプチ ド 。
8. ア ミ ノ酸配列が下記式 [ H ] 、
H2 -Asn-Leu-Va l -Asn-Phe-H i s-Arg-Met-I l e-Lys-Leu
-Thr-Thr-G l y-Lys-6 l u-A l a-A l a-Leu-Ser-Tyr-G l y-P e -Iyr-G l y-Cys-X-Cys-G l y-Va i -G l y-G i y-Arg-G l y- [ H ] のァ ミ ノ酸配列を有するポリ ぺプチ ド及びその断片。
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EP0446350A1|1991-09-18|
EP0446350A4|1991-09-25|
引用文献:
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1989-06-29| AK| Designated states|Kind code of ref document: A1 Designated state(s): JP US |
1989-06-29| AL| Designated countries for regional patents|Kind code of ref document: A1 Designated state(s): DE FR GB |
1989-08-10| WWE| Wipo information: entry into national phase|Ref document number: 1989900894 Country of ref document: EP |
1991-09-18| WWP| Wipo information: published in national office|Ref document number: 1989900894 Country of ref document: EP |
1992-04-28| WWW| Wipo information: withdrawn in national office|Ref document number: 1989900894 Country of ref document: EP |
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